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横谷 明徳; 神長 輝一
放射線生物研究, 49(4), p.418 - 431, 2014/12
最近、細胞標識技術の発展に伴う顕微鏡下でのライブセルイメージングにより、細胞の様々な活動が比較的容易に動画像(ムービー)として観察できるようになった。これらの実験により得られた動画像データは、個々の細胞に関する豊富な情報を含む。このような細胞機能に関するダイナミクスは、従来の免疫染色による静止画像データや細胞集団全体から生化学的に抽出された生体分子の平均化された値からは得ることができない。われわれは、細胞周期がライブセルでモニターできるHeLa-Fucci細胞を試料とし、タイムラプス法を用いてX線照射後に個々の細胞の細胞周期を追跡した。その結果、細胞集団は細胞周期が変調する群とほとんど影響を受けない群の2つに分かれる可能性が示された。このデータに対してシステム生物学的な解釈を試み、HeLa細胞の細胞周期制御とG2/Mチェックポイントのシグナル伝達系に内在する、"デジタル"的なスイッチ機構の存在を推定した。
神長 輝一; 野口 実穂; 成田 あゆみ; 坂本 由佳; 嘉成 由紀子; 横谷 明徳
no journal, ,
To explore X-irradiation effects on the mammalian cell cycle, we performed to track single cells as live cell images observed by the time-lapse imaging technique. HeLa cells with fluorescent ubiquitination-based cell cycle indicator (FUCCI) were used as irradiation sample cells to visualize cell cycle because their nuclei show different colors. We exposed X-rays to the HeLa-Fucci cells and observed them using a fluorescent microscope. We accumulated cells images every 20 min for 48 h and obtained evidences of cell cycle dynamics. The period of G1 and S/G2/(M) phase were analyzed and it was revealed that the irradiated cells were split in two populations, one showing similar cell cycle dynamics with that of unirradiated cells, and another showing modified cell cycle with a prolonged interval before progressing next cell cycle. The heterogeneous mixture of populations of irradiated cells might be involved in finally biological effects such as cell lethality.
坂本 由佳; 嘉成 由紀子; 神長 輝一; 成田 あゆみ; 野口 実穂; 宇佐美 徳子*; 小林 克己*; 藤井 健太郎; 横谷 明徳
no journal, ,
バイスタンダー効果によるスフェロイド中の非照射部を含めた動態を明らかにすることを目的とし、HeLa-Fucci細胞で作製したスフェロイドに対するX線マイクロビーム照射と、その後の経時観察を行うための新しい実験系を構築した。照射サンプルであるスフェロイドは、照射用ディッシュに移し、アガロースゲルを含んだ培地で周囲を満たして、動かないよう固定した。マイクロビーム照射には、KEK-PF、BL-27B(生物ステーション)の装置を利用した。ビームサイズは40
40
mに設定し、直径150mあるスフェロイドの一部分だけを選択的に狙って照射した。照射後は共焦点レーザー顕微鏡を用いて、細胞周期の変化をライブセル観察した。その結果、マイクロビーム照射部の細胞にのみG2アレストがかかり、細胞周期停止や遅延が起こることが確認された。また、マイクロビームを照射していないスフェロイド、マイクロビームを照射したスフェロイドの非照射部のどちらにも、細胞周期の変化は明確には確認されなかったことから、スフェロイドにおけるバイスタンダー効果は小さいと考えられる。
神長 輝一; 成田 あゆみ; 野口 実穂; 嘉成 由紀子; 坂本 由佳; 宇佐美 徳子*; 横谷 明徳
no journal, ,
本研究では、細胞周期を可視化したFucci細胞を試料とし、これに対してX線マイクロビーム照射後、タイムラプスイメージング法で自動観察する実験系を確立した。この実験系では、照射細胞とその周囲の非照射細胞の周期を、個別に追跡することができる。DNA損傷や細胞分裂に必要なタンパク質の発現・機能異常がある場合には、細胞周期に変調(遅延や停止)が生じることが知られているため、細胞周期を追跡することで、細胞内のDNA損傷や細胞分裂に必要なタンパク質の発現・機能異常を検出することができる。HeLa.S細胞をFucci化した細胞に対するマイクロビーム照射の結果、非照射細胞に顕著な細胞周期の変調は観察されなかった。HeLa.S細胞はギャップジャンクションが正常に機能していないことが知られている。今回の結果は、バイスタンダー効果によるDNA損傷の誘発や細胞分裂に必要なタンパク質の発現・機能異常には、ギャップジャンクションが大きな役割を果たしていることを示唆している。
神長 輝一; 篠田 航平; 福岡 壮太郎; 中上 裕貴; 横谷 明徳
no journal, ,
Fucci化されたHeLa細胞を試料として用い、X線照射による細胞周期遅延をライブセル観察により調べた。KEK放射光施設(PF)のBL27Bから得られるX線マイクロビームを利用し、顕微鏡下で細胞に照射した。本顕微照射システムでは、長時間に渡る細胞の継時観察が困難である。このため照射後細胞をビームラインから外し、培養器を備えた別の顕微鏡システムにセットした。オンラインとオフラインの二つの顕微システムにおいて照射細胞の位置座標を共有するため、新たに位置調整用フィルムアタッチメントを製作した。数十個のHeLa-Fucci細胞からなるマイクロコロニー中心部に6060mのX線マイクロビームを照射し、72時間タイムラプス観察を行った。その結果、照射細胞に細胞周期遅延や細胞死、細胞融合などの影響が観察されたことに加え、非照射細胞にも細胞周期遅延が線量や細胞周期に依存して起こることを見出した。これは、新しいタイプのバイスタンダー効果であると考えられる。
横谷 明徳; 神長 輝一; 服部 佑哉; 渡辺 立子; 野口 実穂; 藤井 健太郎
no journal, ,
発がんのプロセスの解明には、放射線照射後に細胞分裂能を失うことなく生存し続ける細胞に現れる変化を、詳細に観察することが重要であると考えられる。そこで、細胞周期により異なる蛍光を発するようFucci化したヒトガン細胞(HeLa-Fucci)に対して、顕微鏡下で特定の細胞を選択した上でX線マイクロビームを照射した。その後72時間ライブセル観察を行った結果、照射細胞の周期がG2期で遅延することが明らかになった。さらに、照射細胞周囲の非照射細胞にも周期遅延が観測され、細胞周期制御にもバイスタンダー効果が現れることを初めて明らかにした。一方、コンピュータを用いて、異なる細胞密度を持つ細胞集団に対する放射線を照射した場合の細胞周期の挙動変化をシミュレートした。その結果、細胞密度が密な細胞集団では、照射により細胞周期が一時停止する細胞数が多くなる結果を得た。これは、培養液中に放出されたシグナル以外にも細胞間のギャップ結合を経由したシグナルの伝達が起こり、バイスタンダー効果が増加することを示している。
神長 輝一; 宇佐美 徳子*; 野口 実穂; 横谷 明徳
no journal, ,
X線マイクロビームを利用し、照射したヒト細胞の周囲の未照射細胞にもバイスタンダー効果により細胞周期ダイナミクスの変化が起こるのか検証を行った。細胞周期を可視化(Fucci化)したHeLa細胞のコロニー(10-20細胞)の中心に、6060mのX線マイクロビーム(0, 10, 20Gy)を照射し、その後72時間のタイムラプスイメージングを行った。得られた画像から、コロニー中の個々の細胞の細胞周期ダイナミクスを系譜図として得た。未照射試料では観察されなかった細胞死が、照射細胞を含むコロニーの未照射細胞にも誘発されたことから、バイスタンダー効果が生じたことが確認された。一方、細胞周期ダイナミクスの変化は、20Gy照射したひとつのコロニーにおいてのみ分裂回数の有意な減少として確認された。これは、バイスタンダー効果により非照射細胞中にもDNAの二本鎖切断が誘発されたため、チェックポイント機構により細胞周期遅延が生じたことによると推測された。